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Condiciones de un buen fijador.Una sustancia fijadora para que ejerza de manera eficiente yadecuada sus funciones debe poseer las siguientescondiciones: Matar inmediatamente a las células, impidiendo laaparición de los procesos autolíticos. Para tal fin elfijador debe poseer:Un buen poder de penetración, que en contadosinstantes se introduzca con rapidez en el espesor de lamuestraUn buen poder de difusión, que no fije sólo la porciónsuperficial de la muestra sino que alcance las porcionesmás profundas de la misma. Producir cierta dureza a los tejidos sin que seprovoque excesiva retracción o hacerlos quebradizos yfriables. Debe de ser de fácil manipulación. No debe disolver componentes celulares. Que sea fácil de conseguir y que sea barato.Las soluciones fijadoras suelen ser fijadores simples, ofijadores compuestos (mezclas fijadoras) en las que utilizanmás de una sustancia fijadora.Ejemplo de fijador simple:Formol o formalina. Está considerado como la sustanciafijadora de mayor uso en los laboratorios que realizantécnica histológica. El formol comercial consiste en unasolución acuosa del gas formaldehido al 39 - 40%. Sepresenta como un líquido claro, incoloro, que emite vaporessumamente irritantes para la conjuntivas y la mucosarespiratoria. Su acción fijadora se ejerce coagulando lasproteínas.A continuación se presentan algunos ejemplos de fijadorescompuestos o mezclas fijadoras que se emplean con mayorfrecuencia: Formol - fosfato (formol tamponado):- solución de formaldehído (37% a 40%)--------------100 ml- agua destilada ------------------------------------------- 900 ml- fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 - H2O)-----4.0 gr- fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)------------------6.5 grSuele emplearse como un fijador de rutina, al igual que elformol al 10%. Posee un pH de 6.8 a 7.0 aproximadamente.Es ligeramente hipotónico. Formol - bicloruro de mercurio.- solución de formaldehído (37% a 40%)--------------150 ml- agua ---850 ml- bicloruro de mercurio-------------------------------------50 grEs recomendable usarlo para fijar tejidos hematopoyético ylinfáticoreticular. El material nuclear se fija de maneraprecisa y nítida. Facilita la tinción de fibras colágenas ycélulas conjuntivas mediante el empleo de colorantes quetienen como base a las anilinas. Se utiliza para los tejidos enlos que se aplicará técnicas inmunohistoquímicas. Lostejidos no deben mantenerse mucho tiempo en fijación (nomás de 48 horas) porque se endurecen demasiado. HgCl2 esuna sustancia que corroe el instrumental metálico. Antes deaplicar una tinción es necesario eliminar los pigmentosprecipitados del bicloruro de mercurio en los tejidos. Formol - cloruro de calcio.- solución de formaldehido (37% a 40%)---------------100 ml- cloruro de 10 gr- agua -----900mlEs un fijador que posee un buen poder de penetración ydifusión. Mantiene de manera adecuada la estructura yfacilita la coloración posterior de los componentes celularesy tisulares. Endurece bien las muestras. Conserva bastantebien a las grasas.Se recomienda fijar las muestras en esta solución cuando sedesean preservar lípidos, especialmente fosfolípidos: Antesde obtener los cortes, las muestras se incluyen en gelatina ose congelan directamente para seccionarlas con empleandomicrotomos de congelación o el criostato.Se le emplea en una solución al 10% (10 del formolcomercial y 90 partes de agua) Líquido fijador de Boüin.- solución acuosa saturada de ácido pícrico-------------750 ml- solución de formaldehido (37% a 40%)---------------250 ml- ácido acético glacial--------------------------------------- 50 mlEl tiempo de fijación de las muestras, dependiendo deltamaño de ellas, debe ser de 24 a 48 horas como mínimo ysi es posible, en refrigeración.Fijadores compuestos.Una sola sustancia fijadora difícilmente reúne todas lascondiciones para ejercer una buena fijación, por lo tanto esaconsejable usar mezclas fijadoras a través de las cuales seacrecientan las cualidades de un fijador y se atenúan susdefectos y desventajas.Es un buen fijador de uso rutinario. Tiene un buen poder depenetración y de difusión. Ofrece resultados satisfactorioscon ciertos tricrómicos como el de Masson. Pueden fijarsepiezas de un centímetro de grosor y dos o tres centímetrosde longitud. Se le emplea con resultados óptimos en lafijación de embriones y fetos pequeños pues ejerce ciertopoder descalcificante. Dependiendo del volumen de lamuestra, el tiempo de fijación será de 12, 24 a 48 horas.3

Antes de la inclusión, es conveniente eliminar el ácidopícrico de las muestras (tiñe de color amarillo intenso a lostejidos)El lavado se hace con una solución de alcohol etílicoal 70% a la que se añaden algunas gotas de una solución al5% de carbonato de litio. El lavado finaliza cuando elalcohol litinado ya no muestra color amarillento. Líquido fijador de Zenker ( Solución madre o stock)- bicloruro de mercurio-------------------------------------50 gr- bicromato de potasio--------------------------------------25 gr- agua destilada ------------------------------------------1000 mlLa solución “madre” se puede guardar durante muchotiempo. Cuando a ella se le añade ácido acético forma el Líquido de Zenker (solución de trabajo):- solución madre (stock) de Zenker-----------------------95 ml- ácido acético glacial-----------------------------------------5 mlEn cambio, si a la solución “madre” de Zenker se le agregaformol comercial se convierte en Líquido fijador de Helly- solución madre (stock) de Zenker-----------------------90 ml- solución de formaldehido (37% a 40%)-----------------10 mlEl formol se debe agregar antes de usar la mezcla, pues laacción reductora del formol inhibe la actividad fijadora delbicromato de potasio. Las muestras deben ser pequeñas yfijarse por un lapso no mayor de 24 horas, porque seendurecen en exceso, se disminuye la basofilia de losnúcleos y se incrementa la acidofilia del citoplasma. Tieneuna ventaja: preserva muy bien a los eritrocitos y a losgránulos de las células de glándulas endocrinas. Fijador de Carnoy,- alcohol etílico absoluto------------------------------------60 ml- ----------30 ml- ácido acético glacial---------------------------------------10 mlPosee un excelente poder de penetración y de difusión. Lasmuestras delgadas de tejidos y órganos se fijan en dos o treshoras. Produce lisis de los eritrocitos. Es el fijador adecuadocuando se desea demostrar glucógeno y la tinción denúcleos y especialmente cromosomas.CRITERIOS PARA OBTENER UNA BUENAFIJACIÓN.a) Elección del fijador. La solución fijadora a utilizardepende del estudio que se quiere realizar. Para laspreparaciones de tejidos y órganos, en las que interesanun estudio topográfico de los mismos, deben usarsefijadores con un buen poder de penetración y dedifusión. Para estos casos se recomienda utilizar loslíquidos de Zenker, Boüin o Helly: En caso contrariose empleará la solución de formol al 10% ó 15% quepermite obtener resultados satisfactorios. Líquidoconsiderado como el “fijador universal” pues facilitael empleo posterior de cualquier otro fijador(postfijación) capaz de complementar su acción.b) Tamaño de las muestras. El tamaño y grosor de lasmuestras deben ser pequeñas y delgadas, de 1cm2 a 2cm2 y con un espesor de 2 mm a 5 mm, especialmentesi se emplean fijadores con escaso poder de penetracióny de difusión.c)Volumen del fijador. Una proporción que es necesarioemplear será de 1 a 20 (muestra – fijador). Será la másadecuada para garantizar una buena fijación.d) Tiempo de fijación. El tiempo en la fijación esimportante en dos aspectos.I. El intervalo que media entre la interrupción delaporte sanguíneo y la inmersión de las muestras enla solución fijadora. Lo deseable es que lasmuestras se fijen inmediatamente después deobtenidas mediante una biopsia o que la necropsiase efectúe al poco tiempo de producida la muerte.Mientras más largo es este lapso, los procesosautolíticos que sufran los tejidos serán másevidentes.II. Debe tenerse en cuenta el tiempo quepermanecerán las muestras sumergidas en losfijadores. Este tiempo varía con relación al tipo defijador que se utiliza; al tamaño y la naturaleza dela muestra y la temperatura de fijación. Por lo tantolos lapsos de fijación varían en rangos muyamplios. En cualquier circunstancia, siempre debenrespetarse los tiempos recomendados para cadatipo de fijador para garantizar la conservación deuna buena estructura celular y tisular de los tejidos.e)Temperatura de la fijación. Es recomendable efectuarla fijación a bajas temperaturas ( 4o C.) dentro de unrefrigerador y con la solución fijadora enfriadapreviamente. Este procedimiento retardará el tiempo defijación pero disminuirá de manera notable la autólisisde los tejidos.Fijación por perfusión.Un método de fijación casi instantáneo es aquel que consisteen perfundir los tejidos y órganos de un animal con unasolución fijadora. Este procedimiento se utilizafrecuentemente para fijar tejidos que serán procesados yexaminados mediante el microscopio electrónico. Laperfusión consiste en anestesiar el animal y, mediante unsistema especial de inyección y drenaje, reemplazar lasangre con una solución salina y después se inyecta elfijador. La fijación se hace en contados instantes paragarantizar que los tejidos se fijaron rápidamente.4

Cualquiera que sea el medio de inclusión a emplear escondición indispensable que la muestra a incluir seencuentre embebida en la sustancia que disuelve al medio deinclusiónInclusión en parafina. Después de la fijación y el “lavado”de las muestras, éstas se encuentran embebidas en agua o enalcohol, por lo que resulta imposible que se infiltren conparafina, medio de inclusión insoluble en agua y alcohol.Por lo tanto, para que los tejidos puedan ser incluidos enparafina se requiere deshidratarlos e infiltrarlos con elsolvente de la sustancia de inclusión.Los pasos a seguir para la inclusión de las muestras enparafina son:Fig Tec. de tinción: perfusiónf)Almacenamiento de las muestras. En ciertos casos lostejidos fijados no necesitan ser procesadosinmediatamente para aplicarles otros pasos de la técnicahistológica. Por lo tanto es conveniente almacenar yconservar los tejidos fijados para un uso posterior.Después de eliminar el fijador mediante un “lavado”, seguardan en una solución de alcohol al 70%. Así lostejidos pueden guardarse por un tiempo bastante largosin que sufran modificaciones morfológicas notorias.g) Lavado de las muestras fijadas. Al concluir la fijación,el fijador debe ser eliminado de las muestras. Para talfin se procede al lavado de los tejidos mediante agua oalcohol. Se evita, así, que los tejidos se endurezcandemasiado o que ciertos componentes del fijadorintroduzcan modificaciones en los tejidos e impidanuna adecuada obtención de secciones delgadas o lacoloración correcta de sus componentes celulares.C) INCLUSION.Los tejidos fijados adquieren cierta consistencia ydureza, pero no la suficiente para que, de ellos, seobtengan secciones delgadas. Estas secciones, del ordende algunas milésimas de milímetro (5 a 10 m), seconseguirán cuando los tejidos se infiltren consustancias denominadas “de inclusión” y adquieran taldureza que sometidos al filo de una navaja produzcansecciones, cortes o láminas sumamente delgados ytransparentes.Las sustancias de inclusión tienen la propiedad deincorporarse e infiltrarse al interior de las células ytejidos con la finalidad de servirles de soporte. Así lostejidos y la sustancia de inclusión forman un bloquehomogéneo en dureza y consistencia, a pesar que suscomponentes tuvieron originalmente distinta dureza.Existen una serie de sustancias de inclusión que se hanempleado o se utilizan actualmente. Unas son solublesen agua (gelatina, carbowax, glicol metacrilato) otras,solubles en solventes orgánicos (parafina, celoidina,resinas epóxicas).a) Deshidrataciónb) Impregnación en el solvente ( a este pasotambién se le denomina aclaración o diafanización)c) Inclusión y formación del bloque de parafinaa)Deshidratación. Significa extraer o remover el agua delos tejidos fijados. La deshidratación debe ser completaporque, de lo contrario, el solvente no actúa de formaadecuada y el bloque de inclusión no alcanza la durezarequerida. Para tal fin se utilizan líquidosdeshidratadores en los cuales se sumergen los tejidos.Los deshidratadores más usados son el alcohol etílico,el alcohol isopropílico, el dioxano y el cloroformo.En el caso de la inclusión en parafina, las muestras sedeshidratan en baños sucesivos en soluciones deconcentracióncrecientes de alcohol etílico. Elprocedimiento de rutina es el siguiente:1) alcohol etílico al 70 % ------------------- 12 horas2) alcohol etílico al 70 % ------------------- 12 horas3) alcohol etílico al 95 % --------------------- 1 hora4) alcohol etílico al 95 % --------------------- 1 hora5) alcohol etílico al 100 % (absoluto) --------1 hora6) alcohol etílico al 100 % (absoluto)---------1 a 1.5 horas.Nota: En cada caso es necesario agitar de vez en cuandolos frascos que contienen las muestrasLos tiempos indicados son los que se aplicarán a lasmuestras de tamaño mediano (1 cm2 x 0.5 cm. de grosor).Los tiempos pueden disminuirse o incrementarse si laspiezas son más pequeñas o más grandes.La deshidratación incompleta de los tejidos se compruebacuando éstos al sumergirse en el líquido diafanizadormuestran un aspecto turbio blanquecino5

b) Diafanización. Las muestras deshidratadas seencuentran totalmente embebidas en alcohol etílicoabsoluto; pero la parafina tampoco es soluble enalcohol por lo que es necesario reemplazarlo porsustancias que sean capaces, simultáneamente, demezclarse con el alcohol y disolver la parafina. Estas sedenominan líquidos diafanizadores o intermediarios.Ejemplos: xilol, tolueno, benceno, y el cloroformo.El líquido diafanizador de uso más frecuente es el xilolLa actividad aclaradora o diafanizadora del xilol se empleatambién en el procedimiento de coloración. La diafanizaciónde los tejidos deshidratados se debe a que estas sustanciasposeen un alto índice de refracción y al interactuar con lostejidos los vuelven transparentes.El procedimiento de diafanización se realiza de la siguientemanera:7) alcohol absoluto (50%) - xilol (50%)--------1 hora8) --1 hora9) --1 horagrumos pequeños. Las parafinas, se disuelven usandoestufas que las mantienen en ese estado. Las estufaspermanecen a una temperatura constante, generalmente de2o C a 4o C por encima del punto de fusión de la parafina aemplear.La parafina diluida se coloca en tres recipientes dentro de laestufa. El primero, con una capacidad de 1000 a 1500 cc,recibirá a las muestras embebidas en xilol; la parafinareemplazará el xilol de las muestras y se infiltrará al interiorde las mismas. Los otros dos recipientes son más pequeños(500 cc. de capacidad) y, de manera consecutiva recibirán alos tejidos. El último de ellos servirá para contener a lasmuestras antes del proceso de formación de los “bloques”de parafina. En el interior de la estufa debe existir otrorecipiente conteniendo parafina líquida pura, que seempleará para la formación de los “bloques”.El tiempo que permanezcan las muestras dentro de losrecipientes de parafina dependerá de la naturaleza del tejidoy el tamaño de las muestras. Se sugieren los siguienteslapsos:10) Primer baño de parafina------------------1 a 1.5 horas11) Segundo baño de parafina----------------1 a 1.5 horas12) Tercer baño de parafina-----------------30 a 60 minutosNota: agitar las muestras con cierta frecuenciaNota: las muestras deben agitarse continuamente parapermitir la renovación de los líquidos.c)Inclusión y formación del bloque de parafina. Lasparafinas son hidrocarburos saturados provenientes dela destilación del petróleo. Generalmente son sustanciassólidas a temperatura ambiente. Existen diferentes tiposde parafina que se caracterizan por sus puntos defusión. Estos oscilan entre 40o y 60o C. La parafinahierve a 300o C. y emite vapores que son muyinflamables. Las parafinas se clasifican en: Blandas. tienen un punto de fusión de 45 o C 52o C. Son recomendables para incluir tejidos �mica. Semiduras. Sus puntos de fusión son de 54o C 58o C. Es la parafina que se emplea con mayorfrecuencia en los laboratorios donde se realizatécnica histológica. De acuerdo a la temperaturadel medio, se recomienda su uso pues se puedenobtener secciones de 5 a 7 de m. Duras. Tienen un punto de fusión de 60o C - 65oC. Son parafinas que deben usarse en ambientescon climas de temperaturas altas.La penetración de la parafina al interior de los tejidos seefectúa cuando ésta se encuentre en estado líquido. En elcomercio las parafinas se expenden en forma de bloquesdiscoidales, escamas, tabletas rectangulares o en forma deLa inclusión o formación del bloque de parafina se efectúaempleando moldes de diversos materiales y diferentes áreasy profundidades. Pueden ser de papel, metal o plástico. Elbloque de parafina debe contener la muestra correctamenteorientada para facilitar la obtención de las secciones o“cortes”.El molde elegido se llena con parafina caliente pura; conuna pinza calentada en un mechero se toma una pieza detejido del tercer recipiente y se orienta una de sussuperficies (aquella que se pondrá en contacto con el filo dela navaja) se sumerge al interior del molde, en el que laparafina ha empezado a solidificarse y se le aplica una levepresión. Después los moldes se enfrían de inmediato (sesumergen en agua fría o se introducen en el refrigerador)para que la parafina se solidifique de manera homogénea.Todos los procedimientos mencionados, desde ladeshidratación hasta la infiltración en los dos o tresrecipientes de parafina líquida, se pueden efectuar demanera automática. Existen una serie de “procesadoresautomáticos” que facilitan estas tareas.Igualmente existen instrumentos que contienen parafinafundida que la dispensan a voluntad del usuario para luegoformar los bloques. Tienen anexos a ellos áreas o superficiesque se mantienen calientes o frías, con la finalidad deorientar correctamente las piezas de los tejidos yposteriormenteproducir el enfriamiento rápido, lasolidificación de la parafina y la formación del bloque.6

D) MICROTOMIA (OBTENCIÓN DE LOS CORTES)En esta etapa, los tejidos y la parafina integran un solobloque que, posee la dureza y la consistencia suficientespara obtener secciones delgadas y transparentes.Las secciones delgadas o “cortes” se obtienen utilizandoinstrumentos mecánicos diseñados para que en forma mas omenos automática, seccionen el bloque de parafina en cortesdelgados y de grosor uniforme. Los instrumentos sedenominan “microtomos”El sistema de funcionamiento de los microtomos consta decuatro mecanismos principales: sujeción del bloque de parafina. sujeción de la navaja. El que permite que el filo de la navaja seccione albloque en cortes delgados y de grosor uniforme. El de avance del bloque en un número determinado demicrómetros después que se ha obtenido un corte.Los microtomos se clasifican de acuerdo a la manera comose desplaza el bloque que contiene el tejido incluido; así,existen:a) Microtomo de rotación tipo Minot.Mediante una manivela circular denominada volante, elmecanismo que sujeta al bloque de parafina se desplazafrente al filo de la navaja, de arriba hacia abajo yviceversa en un movimiento vertical.b) Microtomo de deslizamiento. El movimiento que serealiza para obtener los cortes es horizontal, es decir deatrás hacia adelante y viceversa. Generalmente elmecanismo que sujeta al bloque de parafina es el quese desplaza y a la navaja permanece estática.Los microtomos tipo Minot permiten obtener seccionesdelgadas, del orden de 4 a 7 m de espesor. Producen cortesseriados, es decir, cuando se obtiene un corte, éste quedaadherido por su borde anterior al borde posterior del que loprecedió; formándose de esta manera una cinta de cortes queva descendiendo por la superficie anterior de la navaja.Los cortes seriados se emplean cuando se desea realizarreconstrucciones tridimensionales del órgano procesado,cuando se requieren comparar secciones vecinas, del tejidou órgano, coloreadas por diversas técnicas de tinción ocuando se hace el estudio microscópico topográfico enembriones y fetos.Existen dos condiciones indispensables que garantizan laobtención de secciones delgadas, uniformes y seriadas:a) Que la deshidratación, impregnación e inclusión hayansido realizadas correctamente.b) El empleo de una navaja o cuchilla muy bien afilada yasentada y que el filo de la misma ofrezca lainclinación adecuada hacia la superficie del bloque.Las navajas o cuchillas de microtomía requieren de unafilado y un asentado muy cuidadoso, pues elmantenimiento del filo de ellas depende que se obtengan,con éxito, buenos cortes.Las navajas se afilan utilizando afiladores automáticos queefectúan la operación en forma rápida y garantizan unafilado uniforme.Para el afilado de las cuchillas se requieren una placa devidrio despulida finamente y sustancias abrasivas.Existen varios modelos de afiladores automáticos, perotodos ellos funcionan bajo ciertos mecanismos:a) movimiento y deslizamiento de las cuchillas sobre lasuperficie del vidrio despulido (movimiento rotatorio ode atrás hacia adelante y viceversa)b) movimiento y rotación periódica de las dos superficiesde la cuchilla para enfrentarse de manera alternativa ysimilar a la superficie del vidrio con el abrasivoc)Fig Tec. de tinción: MicrotomoLos microtomos tipo Minot son los de uso más frecuenteen cualquier laboratorio donde de realiza técnicahistológica, especialmente cuando los tejidos están incluidosen parafina. Los microtomos de deslizamiento, en cambio,se emplean cuando los tejidos están incluidos en celoidina ocuando la inclusión en parafina contiene porcionesvoluminosas de tejidos y órganos.En ciertos modelos, la placa de vidrio también puederealizar movimientos restringidos de rotaciónLas sustancias abrasivas suelen estar disueltas en agua o enaceite. Generalmente se emplean dos tipos de abrasivos:Unos, de grano grueso, utilizados para desgastar algunasmelladuras visibles de las navajas y otros, de grano fino quesirven para afilar verdaderamente las navajas.La perfección del afilado se obtiene cuando el filo de lasnavajas se asienta empleando, para t

técnica histológica. .